微生物测序样本准备方法总计

 

微生物 1

在微生物测序中,样本的备选从根本上是承保取得高质量DNA的前提,而样本准备也正是让众多微生物科研工我感到干扰的首要一步。明日就给大家分类介绍一下广泛的微生物样本类型及采样方法

 

微生物测序样本准备方法

 

医口样本类型

样本 种类 推荐生物学重复
肠道 粪便,粘膜 6, 推荐 10
液体 尿,血液,脑髓液,唾液,痰,肺泡灌洗液,羊水 同上
拭子 口腔,生殖道,皮肤 同上
其它 组织,肝脏,眼部,胎盘等 同上

 

农口样本类型

样本 种类 推荐生物学重复
土壤 普通土,根际土,稻田土,污泥,沙土 3(多点取样), 推荐5
水体 水库,河流,污水,海水,中水,油田,尾矿池,牛奶 同上
肠道 动物粪便,肠道 6,推荐>10
其它 根内生菌,瘤胃,发酵液,单菌,病毒 同上

 

医口常见样本采集方法

 

大便样本采集

1)准备好便盆和大便容器,洗手,带上手套收集新鲜的粪便样本;

2)在实验室将装好受试者粪便样本,马上放在冰上进行分装并标记;

3)用无菌牙签或大便取样器截取样品中段里部(粪便表层含有肠粘膜脱落细胞),外部简单传染,且接触空气后,部分细菌
DNA 起先降解;

4)用灭菌离心管每管称取0.5-10g左右粪便样本,每一个样本取多管备份;

5)分装好后,若当天领取DNA,可以先放4°C,长期存放需先神速放入液氮中,之后马上放入-80°C保存。

注:如粪便样品量较多或不能霎时收集,最迟要在2钟头之内全体收集完。

 

肠道内容物样品采集

1)在试验目的离世后,用无菌解剖刀,在无菌状态下取出整个肠道,切取所需肠段的内容物(条件允许的话,可在无菌操作台举行);

2)用无菌手术刀挖取内容物,即刻放在冰上进行分装并标记;

3)用灭菌离心管分装,单个样本取样量:0.2-0.5g/管。为保障实验顺遂进行,逐个样本取多管备份,在采样允许的意况下,尽量多收集样品;

4)分装好后,若当天领取DNA,能够先放4°C,长时间存放需先飞快放入液氮中,之后随即放入-80°C保存。

 

肠道社团样本采集 

1)社团样本用无菌氟铝酸盐缓冲液轻轻清洗,直到没有内容物流出;

2)用无菌的显微镜玻片刮取附着在外表的协会细菌进行DNA的领到;

3)长时间存放需先飞快放入液氮中,之后霎时放入-80°C保存。

 

生殖道样本采集

1)48h内无性行为,不得开展私处清洗、上药等转移菌群结构的行事,30天内不恐怕用抗生素和抗真菌类药物;

2)用无菌棉签丰裕取样,用无菌剪刀剪下棉签底部,放入装有Amies培育基的无菌离心管中,置于冰上带至实验室-80℃保存;

3)样本保护,需举办多管备份保存;

4)提取DNA时将棉签解冻,漩涡处理5min以重悬细胞。

 

唾液样本采集

1)收集唾液样品时,用蜡胶刺激口腔分泌唾液,然后用5mL的无菌离心管收集1mL;

2)所有的样品收集完后放于-80°C下封存。

 

农口常见样本采集方法

 

一般说来土壤样本采集

1)依据钻探目的明确采样范围,取样器具要先期消毒灭菌处理,开首采样;

2)去除表面浮土,使用乙醛火烧的铲子挖取地下5~20cm的土层;

3)去除可知杂质后,土壤过2mm筛网,各个样品从2个及以上采样点采访并混合而成,每5~10g分成一份;

4)保存于无菌离心管中,置于0℃以下运回实验室,用于抽提DNA;

5)如不能即刻提取,置于-80℃保存。

 

根际土壤样本采集

1) 使用的器材要事先消毒灭菌处理,采集20cm深的根际土壤于50mL的无菌管里;

2)
用20目标筛子过筛,去除植物根、动物残骸以及其他废品后分装到无菌离心管里,每管3~5g,快捷放在液氮里积存;

3) 密封后随即放于-80℃储存备用。

 

水体样本采集

1) 依据探讨目的分明采样深度和范围;

2)
采集好的水样必要经过滤膜举行过滤,可以根据水样的污染程度选拔相应孔径的滤膜;

3) 将滤膜-80℃保存备用。

注:清亮水样:可挑选小孔径的滤膜,一般选0.22μm或0.45μm的滤膜,过滤水样体量大于10L;

污染水样:过滤前静置分离悬浮微粒,也足以用大孔径的滤膜预过滤五次,再用小孔径的滤膜进行过滤。

 

活性污泥及沉积物样本采集

活性污泥:从曝气池中取25mL漂浮的活性污泥样本放入无哈弗NA酶的管中,飞速放入液氮并运送到实验室提取DNA;

地表沉积物:取距地表0-10cm的地表沉积物,各种位点取1-2kg的沉积物装入消毒聚加氢苯塑料袋中,登时置于0℃运到实验室进行DNA提取。

 

植物内生菌样品采集

1)用流水冲洗植物根样本表面并摘到小侧根,粘根土壤粒要拓展化学消毒(95%的次氯酸钠2min);

2)用无菌玻璃珠在无菌水中剧烈晃动,物理去除细菌;

3)用手术刀片划开根部协会以自由内生菌;

4)用无菌玻璃珠在9%的生理盐水中振荡,在30℃的尺度下震动4h以分别内生菌;

5)用5μm滤膜过滤,14000rpm,4℃离心收集沉淀并置于液氮中保存。

 

微生物种种性探究拾叁分规样本取样方法

 

小鼠肺泡灌洗液

肺脏感染是一种常见疾病,病原种类多,耐药性强。支气管肺泡灌洗液(
bronchoalveolar lavage
fluid,BALF)直接取材于病变部位,拿到病原菌的时机多,并能大幅度削减口咽部定植微生物群对标本的传染,提升病原菌的分离率。

 

小鼠肺泡灌洗

微生物,一般为颈部和乳房解剖,气管和一旁肺叶结扎。再用穿刺针插入气管上端,生理盐水或PBS反复冲洗,一般为一遍,每遍冲洗次数根据必要控制,
3~两遍即可,具体操作参考:

1)操作所需的装置(全部装备均需是无菌的);

2)小鼠麻醉并定位;

3)颈部去毛并消毒;

4)行颈部正中切口;

5)揭穿剥离气管,并在气管近端穿线打活结,活结要比较松;

6)在所打活结的远端,剪开气管的二分之一,行气管插管,插入后线打死结;

7)1ml注射器抽取1ml的灭菌生理盐水,通过呼吸系统插管注入气管内,注意针头不要插太深,避防风险肺,反复抽吸四遍,将液体抽出,大概能吸出0.7ml左右,放入灭菌离心管内。再抽取1ml生理盐水,重复上边的操作三次,那五次每一回能抽出肺泡灌洗液0.9ml左右,也注入离心管,借使回收时遇上很大的绊脚石即可拔出注射器,收集灌洗液,在灌洗的时候可以轻轻的按摩一下,尤其是回抽的时候可以如此做,可以升高回收的功用;

8)收集的灌洗液选取0.22um滤膜过滤后,将滤膜冻存-80℃,或直接领取DNA。

 

上呼吸系统样本制备

上呼吸系统感染有7/10~五分四是由病毒引起的,包罗鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸系统合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒等。另有五分之一~3/10由细菌滋生,细菌感染可径直感染或继发于病毒感染之后,以溶血性链自养菌最为常见,其次为流感嗜血异养菌、肺癌幽门螺自养菌、指甲隐自养菌等。

 

抽样质感

无菌棉拭子、含采样液的无菌外旋塑料管。

 

鼻腔取样

尽只怕使领悟的光辉照进鼻腔,将清新的鼻咽拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后减缓旋转退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中,底部弃去,拧紧盖子。

 

咽喉取样 

明亮的光泽从检查者肩膀上方照射进张开的口腔,让伤者呼吸,然后发“啊”音,用压舌板轻轻压舌,再用清洁的咽拭子来回擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,然后将拭子头浸入采样液中,尾部弃去,拧紧盖子。

 

注意事项:

1)咽喉取样时,拭子不大概接触到口腔和舌粘膜。

2)取样时间最万幸发病72钟头内,晨起后。

3)鼻腔和咽部样品,可只收集一种,也可同时收集2种并混合。

 

肌肤样本制备

干净的皮层拭子(无菌棉签)来回擦拭皮肤表面,将拭子或棉签放入无菌管内,-80℃保存,干冰运输即可。提出多擦拭多少个拭子,保障取样量。

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