生物协会形成分析软件meerkat4858mgm

一、 运行meerkat

    后边已经依序安装了meerkat
的环境和meerkat,运营了预处理一步,在相呼应的bam文件目录下生成了多量文本,由此,当要用meerkat处理有个别bam文件时,应先将该bam文件移动到专有的1个文书夹,manual中也提议那样用。

     预处理生成的公文包蕴:

     黑名单文件.gz

     isinfo文件:包涵插入大小音信

     pdf文件:插入大小的遍布图,unmapped reads长度的分布图,softclip
reads长度分布图

    
pre.log文件:日志文件,包涵输入的参数,输入输出音信,reads数,unallign
reads数等

     softclips.fq.gz: softlip reads文件,完整的read

     softclips.rdist:softclip 的reads长度分布音信记录

     unmapped.fq.gz:unmapped的reads 文件,完整的read

     unmapped.rdist: unmapped的reads长度的分布新闻

     sr1.fq.gz : 从softclip read 可能 unmaped read 切下来的钦赐bp
的reads

     sr2.fq.gz :  与sr1.fq配对的reads

     三个文件夹包涵1_1fq.gz,1_2fq.gz , 
里面有不一样长度的reads。各个read group 人工的reads 对

   

    

   1.1  meerkat.pl

          perl ./scripts/meerkat.pl [options]

         -b  FIle    已经sort过的bam文件

         -k  int    [0/1]是或不是拔取预处理发生的黑名单文件,暗中认同1

         -d  FLT    call discordant mate pairs
的正统差阈值,默许3.以此选项控制什么寻找discordant
read对,等同于定义最大的concordant
fragment(配对的reads定位到的有的),统计方法是:中位插入大小+d x
sd,假设插入大小分布图狭窄并对称,就利用默许参数,例如上边一二图。借使分布图偏宽,只怕带着长尾,三四图,参数应设为5,对于高深度(>30x),固然分布图狭窄,然而利用5会轻微好一些。倘使峰窄,不过依旧带着叁个尾巴(图五),好像大部分TCGA数据那样,在meekat.pl这一步使用5比3更好

4858mgm 1

 

 

 4858mgm 2

 4858mgm 3

 

 

         -c  FLT    集簇discordant mate
pair标准差阈值,暗中同意和-d相同。控制什么集簇,营造断点的置信区间。等同于定义覆盖断点的最大一些(中位插入大小+c
x sd)。若是-d 选项是5只怕小于5,使用用-c相同的参数,假设-d
相当大,比如10,那么使用更小的-c,比如5。如若数量有很高的测序深度,可能有大规模的正片的变迁,那么使用5而不是3来幸免不可以创设断点的置信区间。

         -p  FLT    call三个事变资助的配对数阈值,暗中认同2

         -o  INT   
须要协助全长reads对的数量,暗中同意是0,设定那个选项会回落小复杂事件的敏感度。倘若使用-a
1 -l 1引进应用-o 1 来幸免重复连串导致的广大人工产物

         -q  INT    call2个风波支持的split reads数,默许是1

         -z  INT    事件数的最大值,默许1,000,000,000

         -s  INT    从unmapped reads
初步和后边切下来的bp数,必须和与拍卖的-s 参数设置一样

         -m  INT    [0/1],假设设定为1,使用meerkat
去去除duplicates,假诺设为0,使用Picard 的 flag ‘d‘ marked
,可能其余工具去除duplicates.bwa mem 的数目必须用picard mark duplicate
,所以要设为0.

          -a  INT   
[0/1],处理非单一比对,私自认同1。若是测序质量不好,可能测序深度不够,将参数设为0,那样一切成对的reads都被当做单一比对使用。那依赖bwa
mapping 时生成的XT标签。尽管没有XT标签,使用拔取Q.

          -u  INT   
[0/1],使用bam文件的整整比对,倘使BAM文件不是由BWA暴发的,可能由bwa暴发不过并未XT标签,那么开这么些选项,开了这一个选项会强制关闭-a选项。暗中同意是0。开了这些选项之后应使用-Q
参数过滤低mapping
reads,推荐-Q设置10,对于bwa比对过的bam,也足以一连过滤。

          -Q  INT    被使用的reads的小不点儿mapping quality,默许是0

          -g  INT    
在显要的bam文件使用的备择mapping数,暗许使用全部。备择mapping
数之前经过bwa -N 参数输出到XA标签中。bwa mem 专擅认同 输出备择mapping。

          -f  INT    在clipped
比对中考虑的备择mapping数,暗许使用任何。

          -l  INT    [0/1],是还是不是考虑clipped
比对,暗许1.和预处理一样,对于bwa mem 出来的基因组,不须求重新mapping.

          -t  INT    在bwa比对中用到的核数,默许1

          -R  STR    包涵黑名单read group的文书,每一行二个read
group ID

          -F  STR    fasta文件夹路径

          -S  STR    samtools路径,如若samtools不在环境变量中的话

          -W  STR    bwa路径,如若bwa不在环境变量中的话

          -B   STR    blastall 和 formatdb
的门径,如若不在环境变量的话

          -P  STR   
内定运转顺序,dc|cl|mpd|alg|srd|rf|all,默许all,每一步运营都急需上一步的结果

                            dc:  extract discordant read
pairs,提取discordant read对

                            cl:  construct clusters of discordant read
pairs,将discordant read对建簇

                            mpd: call events based on read
pairs,基于read 对call 事件

                            alg: align split reads to candidate break
point regions,比对split read
到候选的断点区域。假若您有多为重的话,可以将alg步骤切为两步,alg1和alg2,alg1周转二十八线程,alg2运维单线程。

                            srd:  confirm events based on split reads
and filter results,基于split reads和过滤的结果对事件进展求证

                            rf: refine break points by local
alignments,通过区域比对定义断点

                            all: run all above steps ,运营总体步骤

           -h    帮助

    manual 中的举例:

    50bp reads,<10x 的TCGA 基因组    使用-s 18 -d 5 -a 0 -l 0 -q
1,估量:reads 长度较小,所以取33.33% read 长度,-s 取18, TCGA
基因组,插入分布狭窄带尾,所以-d 设为5, 测序深度较低,reads
长度较短,所以尽大概保留数据,-a 设为0, -l 设为0,-q 设的较低,1。

    75-101bp reads, 30-40x TCGA 基因组    使用-s 20 -d 5 -p 3 -o 1
-a 0 -u 1 -Q 10,揣测:reads长度较长,取伍分之一read尺寸,-s 取20,TCGA
基因组,插入分布狭窄带尾,所以-d
设为5,长度较长,深度较深,因而下跌敏感度,增加特异度,所以-p 设为3,-o
设为1,由于并未XT tag和XA tag ,因而-a 1 选项没办法运营,由此设为-u 1 -a 0
-Q 10 。假若那是bwa mem的数据的话,参数应设为-s 20 -d 5 -p 3 -o 1 -m 0
-l 0,bwa mem 数据不必要再行比对softclips -l
0,必须用picard去除duplicate,-m设为0,估算这几个是早版本的bwa,由此比对时方可生成XT标签,-a
私行认同为1。

    101bp reads, 60-80x TCGA 基因组    使用-s 20 -d 5 -p 5 -o
3,75-101bp 使用-s 20,TCGA基因组使用-d 5,测序深度深,-o 设置更高3。

   
如若肿瘤基因组60x,相呼应的不奇怪基因组30x,那么使用60x的参数,平常用配对的正规协会中的black.list.gz
重命名并放到肿瘤bam文件处理的公文夹,替换cancer的blacklist.gz文件。

       

     1.2 mechanism.pl

       perl
./scripts/mechanism.pl [options]

        -b  FILE    sort过的bam文件

        -o  INT    [0/1]在TE包括rmsk类型 \”Other\”,默认1

        -t  INT    TE的最大值,暗中认可一千00

        -z  INT    被处理的SV的数量限制,默许一千000000

        -R  STR    repeat注释路径,可以从UCSC下载

        -h  help

 

二、参照

   
manual中提交的数目,HapMap个体NA18507(42x深度,100bp读长,500bp插入大小),用10核bwa比对开支1.5天和10GB的内存。30x深度的瘤子数据,要多于二日并且当先30G的内存,假设测序质量不太好,比如很多的嵌合比对和许多非单一mapped的reads,就会开支更多的时辰和内存。、

 

三、结果

   
运营完预处理和meerkat.pl后,可以取得七个文件.intra.refined.typ.sorted和inter.refined.typ.sorted,运营完mechanism.pl后,会得到.variants文件,否则,就该回去看一下装置是不是现身难点。

    
运转的肿瘤基因组文件的时候,一定要把健康协会的blacklist文件替换肿瘤基因组的blacklist文件,blacklist文件可以在预处理中生成。如若在预处理中冒出错误新闻“differing
read lengths“,没有涉嫌,仅仅是报告您在局地read group中长度不平等。

 

 肆 、蕴涵的其余程序

    4.1
转换variant 文件到vcf格式**
   **

perl ./scripts/meerkat2vcf.pl -i variantfile -o vcffile -H headerfile -F /db/hg18/hg18_fasta/

    -F选项可以生出几个头文件

    4.2  融合基因注释

 

perl ./scripts/fusions.pl -i variantfile -G /db/hg18/refGene_hg18_sorted.txt

 

    4.3  为形成位点设计引物

        使用primer.pl

        -i  FILE    输入文件,fusion.pl产生的同心协力文件

        -o  FILE    输出文件

        -p  ST本田CR-V    引物固定连串

         -c  INT   
列数补偿,暗许0,假若第1列存在什么样事件的样品名称,那么设为1

         -f  INT    侧翼区域,暗中认可500,设计引物所在的区域

         -s  STOdyssey    被“,”分隔的引物大小,暗中认可20,23,25,27

         -m  ST宝马X3    引物最小,最优,最大Tm值,”,”分隔,默许50,60,65

         -n  INT    对每2个引物片段,设计的音物个数,暗许5

          -r  INT    掩盖repeat,默认0

          -q  INT    输出设计引物的侧翼系列

          -F  STSportage    fasta文件文件夹路径

          -P  STR    primer_core程序文件夹路径

          -L  STR    bla文件夹t路径

          -V  ST普拉多    blat服务器,例如fServer start 10.11.240.76
17777/reference/hg18/hg18.2bit -stepSize=5,服务器路径应该为10.11.240.76

          -T  STCR-V    blat端口,上边例子中的17777

          -h  help

   
全体音物都以由Primer3生成,对于每贰个轩然大波,挑出.1和.2,不一样的趋向认为是例外的轩然大波,所以取引物的时候一向拷贝出来,不须求卓殊的反向互补,假设体系是小写字母,那么评释引物在再一次体系。理论上,你应该用
1 blat hit 挑出小写的引物。倘诺blat hit
是0,意味着由太多hit了,所以不要采取这种引物。有时候,尽管引物是在再次体系上(小写字母),但是在基因组上还是是单一比对的,(1
blat
hit),因为是重新元件的变异,挑选那种引物是可以的。假设由局地引物PC猎豹CS6没有结果,你可以挑选贰个正向引物,四个反向引物来还要拓展六个PCRubicon 反应。引物设计的广大规则依然要运用,比如,你应该选用TM
值相差相当的小并且GC含量不太极端的。

    4.4  计算等位基因频率

        使用discon.pl,这一个脚本会告诉你一切断点的discordant 和
concordant的read对.

        -i  FILE    输入variants 文件,必须

       -o  FILE    输入文件,必须

       -D  INT    从bam文件中总结discordant
pair的多少,暗中同意0,基因分型的时候打开那几个选项

       -B  FILE    bam文件,必须

       -C  FILE    由Meerkat 产生的cluster文件,必须

       -I  FILE    Meerkat 运营时发出的isinfo文件

       -K  FILE    包蕴要不经意的read group的公文名,一个read ID 一行,和
meerkat.pl的QX56参数一样

       -S  FILE    samtools文件夹路径,假诺samtools不再环境变量中

       -d  FLT    call discordant read 对的标准差阈值,暗许3

       -Q  INT    使用的reads 最小的mapping quality,默认0

       -h  help

      

perl ./scripts/discon.pl -d 5 -Q 10 -i $somaticg -o $somaticg_rp -B $cancer_bam -C
$cancer_cluster -I $cancer_isinfo -K $cancer_blacklistrg -S /home/ly55/opt/samtools/

    结果文件之中每3个风云有一个 奥迪Q5P tag ,A_B_C_D格式

    A:全长的discordant read 对数

    B:从局地比对的reads中discordant的reads数

    C:第二断点的concordant reads 数

    D:第壹断点的concordant reads数

    A+B应该等与Meerkat得到的总的reads数

       

 

 以上内容仅作个人笔记使用,仅供参考

 

参考资料

meerkat manual
:http://gensoft.pasteur.fr/docs/Meerkat/0.189/Manual\_0.189.pdf**
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